سابقه و هدف: استفاده از شاخص های آنتی ژنیک انتامباهیستولیتیکا مانند آنتی ژن پروتئین غنی از سرین انتامباهیستولیتیکا SREHP)) جهت تهیه واکسن، برسی تنوع ژنتیکی و تشخیص قطعی و افتراق آن از انتامبا دیسپار کاربرد بیشتری پیدا کرده است. این مطالعه با هدف بیان پروتئین نوترکیب غنی از سرین انتامبا هیستولیتیکا به منظور استفاده در کیت تشخیصی الایزا انجام شد.روش بررسی: در این تحقیق که یک روش توصیفی از نوع اکتشافی است، ابتدا ژن SREHP ایزوله ایرانی که قبلا در پلاسمید بلواسکریپت (pBSc) کلون شده بود، با استفاده از آنزیم BamHI جدا گردید و پس از تخلیص از ژل در پلاسمید بیانی pET32a کلون شد. از روش های غربالگری شامل روش سریع (Quick check) با استفاده از محلول Rosconis، PCR با پرایمرهای اختصاصی SREHP و pET و برش آنزیمی با آنزیم های BamHI و HindIII جهت تایید کلونینگ استفاده شد. ترادف نوکلئوتیدهای ژن با روش سکوئنسینگ تعیین گشت و پلاسمید نوترکیب حاوی ژن SREHP جهت تکثیر به سلول پذیرای BL21(DE3) انتقال یافت. در نهایت ازکلنی حاوی پلاسمید نوترکیب کشت انبوه تهیه شد و پروموتور ژن با IPTG القا و وجود پروتئین نوترکیب بر روی ژل SDS-PAGE بررسی گردید.یافته ها: ژن SREHP در پلاسمید بیانی pET32a ساب کلون گردید و صحت کلونینگ با روش های غربالگری سریع (Quick check)، PCR با پرایمرهای اختصاصی SREHP و pET T7 promoter و برش آنزیمی با آنزیم های BamHI و HindIII تایید شد. ترادف نوکلئوتیدهای ژن با اندازه 666 نوکلئوتید تعیین گشت و ژن کلون شده در پلاسمید بیانی در حضور IPTG در مدت زمان 5 ساعت در محیط کشت ابراز شد. وجود پروتئین نوترکیب غنی از سرین انتامبا هیستولیتیکا به انضمام تیوردوکسین (Trx-Tag) موجود در pET32a با وزن ملکولی 44 کیلودالتونی در کنار مارکر بر روی ژل SDS-PAGE مشاهده و مورد تایید قرار گرفت.نتیجه گیری: با توجه به کاربرد زیاد پروتئین نوترکیب غنی از سرین انتامباهیستولیتیکا در تهیه کیت های تشخیصی و تهیه واکسن از آن علیه تک یاخته انتامباهیستولیتیکا، در این مطالعه پروتئین سرین ریچ (SREHP) با موفقیت بیان شد.

لطفا برای مشاهده چکیده به متن کامل (PDF) مراجعه فرمایید.

لطفا برای مشاهده چکیده به متن کامل (PDF) مراجعه فرمایید.

باکتری اشرشیاکلی یکی از مهمترین میزبان ­های مورد استفاده برای تولید پروتئین نوترکیب می ­باشد. به عنوان مثال، بیشتر پروتئین­ های دارویی که توسط سازمان غذا و داروی آمریکا جهت مصرف مورد تایید قرار گرفته ­اند در اشرشیاکلی تولید شده اند. یکی از مزیت­ هایی که این موجود را به یک کارخانه مناسب جهت تولید پروتئین­های نوترکیب تبدیل کرده، شناخت کامل ماهیت زیستی آن می­ باشد. این امر سبب شده است که در سال­ های اخیر امکان ایجاد تغییرات جهت دار برای مبدل ساختن این کارخانه کوچک به سامانه­ ای هوشمند برای ساخت آسان­تر انواع پروتئین ­های نوترکیب با ویژگی­ های گوناگون فراهم شود. به طوری که هم اکنون سویه­ های مهندسی شده­ ی مختلف و بسیار پرکاربردی برای تولید مقدار بالا و پایدار پروتئین­ های مورد نظر از سویه­ های والد و وحشی به دست آمده است که در آزمایشگاه و صنعت قابل استفاده می­ باشد. در این مقاله مروری ما به معرفی تعدادی از این سویه­ ها که پرکاربردتر هستند می­ پردازیم.

هدف: پروتئازها از مهم ترین آنزیم های صنعتی محسوب می شوند. معمولاً برای تولید این آنزیم ها برای مصارف صنعتی از باکتری های متعلق به جنس باسیلوس استفاده می شود. هدف از این پژوهش جداسازی، همسانه سازی، تعیین توالی، بیان و بررسی بیوانفورماتیکی ژن سرین پروتئاز yyxA استخراج شده از باکتری باسیلوس لیکنی فورمیس بود. مواد و روش ها: در این مطالعه، پس از استخراج DNA باکتریایی، ژن سرین پروتئاز با نام yyxA از باکتری Bacillus licheniformis با استفاده از تکنیک واکنش زنجیره ای پلی مراز جداسازی و در ناقل pTG19-T و سپس ناقل pET28a همسانه سازی شدند و ساختار مولکولی، ویژگی های بیوشیمیایی و فیلوژنتیکی آن مورد بررسی قرار گرفت. ساختار سه بعدی آنزیم همسانه سازی شده با استفاده از ابزارهای PHYRE2، I-TASSER، RAPTORX و Modeller پیش بینی شد. تأیید بیان ژن yyxA توسط آنالیز SDS-PAGE و دات بلاتینگ انجام شد. نتایج: درستی همسانه سازی به وسیله توالی یابی تأیید شد. تولید پروتئین نوترکیب با القاء IPTG به میزبان حاوی پلاسمید pET28a-yyxA با موفقیت انجام شد. بهینه سازی تولید پروتئین نوترکیب مورد بررسی قرار گرفت. بیشترین مقادیر بیان در دمای 37 درجه سلسیوس و طی زمان 4 ساعت و با IPTG یک میلی مولار به دست آمد. نتایج حاصل از بررسی های فیلوژنتیکی، توالی پروتئینی به دست آمده شباهت زیادی را با توالی های سایر باسیلوس ها از قبیل B. subtilis، B. gobiensis و B. pumilus نشان دادند. پس از ارزیابی مدل های ترسیم شده مشخص گردید که مدل ارائه شده توسط نرم افزار PHYRE2 و I-TASSER مدل های مطلوبی برای پیش بینی ساختار سه بعدی این پروتئاز هستند. نتیجه گیری: توالی نوکلئوتیدی ژن yyxA به طول 1212 نوکلئوتید بوده که پروتئینی با 403 آمینواسید را رمز می کند. بررسی ها نشان داد که آنزیم کد شونده توسط این ژن در دسته آنزیم های پایدار قرار گرفته و در باکتری اشریشیاکلای به صورت محلول بیان خواهد شد که این مزایا موجب می شود که آنزیم مذکور به عنوان گزینه مناسب برای استفاده در صنعت در نظر گرفته شوند.

امروزه با استفاده از مهندسی ژنتیک، پروتئین های نوترکیب می توانند در حجم انبوه، کیفیت مطلوب و هزینه پایین برای پاسخگویی به خواسته های صنایع مختلف تولید شوند. پروتئین های نوترکیب می توانند در روش های بیانی مختلفی نظیر سیستم های بیانی عاری از سلول یا بر پایه سلول های پروکاریوتی یا یوکاروتی بیان شوند. با توجه به مزایای استفاده از سلول های پروکاریوتی، یکی از سیستم های متداول برای تولید پروتئین های نوترکیب، استفاده از باکتری اشریشیاکلی (E. coli) است. هدف از مطالعه حاضر بررسی دقیق تر بیان پروتئین نوترکیب در باکتری E. coli و ارایه راه کارهای مناسب برای دستیابی به کشت با تراکم سلولی بالا و با قابلیت بیان بیشینه است. از این رو با مطالعه حدود 63 مقاله چاپ شده در زمینه مهندسی ژنتیک، سیستم های بیانی گوناگون برای تولید پروتئین های نوترکیب معرفی و سپس راهکارهای عمومی برای بیان بالاتر آنها بررسی شدند. رویکردهای متعددی برای افزایش بازدهی و حلالیت به کار گرفته شده است؛ تغییر سرعت سنتز پروتئین ها، استفاده از پروتئین های اتصالی، موتاسیون در پروتئین هدف، بیان هم زمان چاپرون های ملکولی و بهینه سازی شرایط کشت از جمله روش هایی است که در این مطالعه ارزیابی شده اند. کلونینگ مجازی در بستر توسعه روش های نرم افزاری و پایگاه های اطلاعاتی غنی تر به کمک ابزار و آزمون های آزمایشگاهی آمده و توانسته است به رفع محدودیت های بیان نوترکیب پروتئین ها در میزبان هایی با سیستم بیانی متفاوت منجر شود.

مقدمه: ویبریوکلره یک باکتری گرم منفی است که باعث ایجاد بیماری وبا می شود. به دنبال خوردن مواد آلوده به این باکتری، باکتری در روده باریک میزبان شروع به کلونیزاسیون و تولید انتروتوکسین می کند. یکی از مهمترین عوامل بیماری زای باکتری پیلی (TCP) است. این پیلی به عنوان اولین فاکتور در کلونیزاسیون و تداوم باکتری ها در روده کوچک مورد نیاز است. باکتری پیلی هم- تنظیم شونده با توکسین به صورت پیلی تشکیل دهنده دسته ای است که به شکل هماهنگ با توکسین کلرا (CT) تنظیم می شود. توکسین کلره به عنوان بخشی از ژنوم باکتریوفاژ رشته ای (CTXQ) است، به طوری که این باکتریوفاژ از پیلی هم- تنظیم شونده با توکسین به عنوان گیرنده خود استفاده می کند. هدف از این مطالعه تولید یک واکسن نوترکیب برای ویبریوکلره در آینده است.روش: در این مطالعه ژن tcpB با روش PCR تولید شد. سپس به داخل وکتور بیانی pET32 a وارد گردید. سلول های مستعد E.coli. BL21(DE3)plays به وسیله پلاسمید نوترکیبpET32 a – tcpB  ترانسفورم گردید. سپس در محیط های کشت متفاوت با تغییر دادن پارامترهایی مثل گلوکز به عنوان منبع کربن، عصاره مخمر به عنوان منبع نیتروژن، بیان پروتئین با استفاده از IPTG انجام شد. پروتئین نوترکیب به وسیله کروماتوگرافی تمایلی Ni-NTA تخلیص گردید. در نهایت میزان پروتئین خالص شده با استفاده از روش براد فورد اندازه گیری شد. یافته ها: نتایج تعیین توالی با روش سنجر نشان داد که توالی ژن شباهت کامل باژن tcpB دارد. باکتری E.coli,BL21(DE3), plysS به وسیله pET32a-tcpB ترانسفورم شد و بیان ژن به وسیله IPTG صورت گرفت. پروتئین بیان شده توسط کروماتوگرافی تمایلی و به وسیله کیت Ni-NTA تخلیص گردید.نتیجه گیری: تولید پروتئین نو ترکیبtcpB ، ویبریوکلره در سیتوپلاسم باکتری اشریشیا کلی با استفاده از پلاسمید بیانی pET32a انجام گرفت. تولید این پروتئین در میزبان اشریشیا کلی سویه plysS با استفاده از وکتورهای بیانی مثل  pET 32aدر این مطالعه امکان پذیر است.

هدف: باکتری اشرشیاکلی O157:H7، از زیرگروه اشرشیاکلی های خونریزی دهنده داخلی (انتروهموراژیک اشرشیاکلی) است. این باکتری تولیدکننده توکسینی شبیه شیگا توکسین است که در ایجاد اسهال های خونی، غیرخونی و نشانگان یورمی همولیتیک نقش دارد. نشانگان یورمی همولیتیک یک عامل مهم ناتوانی کلیوی در کودکان و بزرگسالان است. ژن fepA از باکتری اشرشیاکلی O157:H7 با 2241 جفت باز، پروتئین غشایی به نام پروتئین اتصالی فریک انتروباکتین را کد می کند که برای جذب فریک انتروباکتین در باکتری اشرشیاکلی ضروری است. در صورت ممانعت از جذب آهن توسط باکتری، می توان میزبان را از تهاجم آن ایمن نمود. در این مطالعه تاثیر ایمنی زایی پروتئین غشایی  FepA بررسی شد.مواد و روش ها: به منظور تهیه پروتئین نوترکیب FepA، پس از کشت باکتری اشرشیاکلی O157:H7، ژنوم آن به روش لیز قلیایی تخلیص شد. با کمک واکنش زنجیره پلیمراز ژن fepA از اشرشیاکلی به طول 2241 جفت باز فراوان سازی و سپس روی ناقل بیانی  pET28a(+)کلون شد. پس از انتقال سازه نوترکیب به میزبان اشرشیاکلی سویه Bl21DE3، بیان پروتئین مورد نظر توسط غلظت های مختلف ایزوپروپیل تیو بتا - دی گالاکتوزید القا و بهینه سازی شد. نتایج بیان با SDS-PAGE بررسی و پروتئین نوترکیب از طریق کروماتوگرافی میل ترکیبی با کمک ستونNi-NTA  تخلیص شد. در نهایت پس از تزریق پروتئین تخلیص شده به موش و تکمیل دوره ایمن سازی، تیتر آنتی بادی با سنجش الایزا ارزیابی شد.نتایج: پروتئین نوترکیب با وزن 85 کیلودالتون تولید و تخلیص شد. تزریق پروتئین به موش های Balb/C نشان دهنده توان بالای آن در تحریک سیستم ایمنی و تولید آنتی بادی و نیز توان آنتی بادی تولید شده در شناسایی پروتئین اتصالی فریک انتروباکتین که منجر به تقویت مقاومت موش در برابر106LD50  است.نتیجه گیری: با توجه به توان بالای آنتی بادی نوترکیب در شناسایی پروتئین اتصالی فریک انتروباکتین، امکان استفاده از این آنتی بادی در محدود کردن رشد و توسعه انتروباکتریاسه مطرح می شود.